在做新藥研發(fā)時，沒有對應(yīng)的中藥標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)需要自制了標(biāo)準(zhǔn)品，可是關(guān)于標(biāo)化的問題一直弄不太明白。一直認(rèn)為應(yīng)該是我用各種能用到的方法來測定它的含量，然后取一下平均值就可以了。原本是打算用非水滴定，HPLC(UV檢測器)，HPLC(蒸發(fā)光檢測器)三種方法來確定一下含量的。可是昨天碰到了一個前輩，他說這么做是錯誤的，應(yīng)該用HPLC的幾種檢測器都來做一下，然后從中選出結(jié)果最好的那個，比如說是UV檢測器，然后用同一個流動相，同一根柱子，一個波長，分別在三臺不同廠家生產(chǎn)的HPLC儀上測定，再取其平均值才是標(biāo)準(zhǔn)品的含量。有這種說法嗎?
個人覺得那我還不如用兩個不同的流動相在同一臺機(jī)器上測定，然后取其平均值呢?
兩個方法我覺得都不妥，你用HPLC測定標(biāo)準(zhǔn)品的含量，那么用什么做對照呢?這是外標(biāo)法的問題;如果你用內(nèi)標(biāo)法，那么內(nèi)標(biāo)怎么選?是不是合適呢?專家也會提出這樣的問題;那么你會說用歸一化法，可是這個方法本來就存在著條件摸索的問題，你采用的液相條件能確定把所有的雜質(zhì)給分離嗎?所以現(xiàn)在化藥一般決不會用歸一化法來測含量的。
所以推薦采用非水滴定法，只要你確定標(biāo)準(zhǔn)滴定液濃度正確，滴定方法得當(dāng)，專家不會提出太大問題。我們以前沒有標(biāo)準(zhǔn)品時都會用滴定法確定標(biāo)準(zhǔn)品的含量，全部都通過。
我想原因應(yīng)該是使用HPLC(UV檢測器)，對一個新藥建立含量測定方法，本身這個條件就是在不斷的摸索過程中建立起來的。你不能說你建立的這個方法是最好的，只不過是這個方法滿足了各方面的要求，這個方法你可以使用而已。肯定應(yīng)該還存在著和你這個條件更好或者是差不多一樣的條件。就拿我這個藥來說吧，我就找到了兩個都不錯的條件，緩沖鹽不一樣，PH值也不一樣，但效果都不錯，后來我就選了理論塔板數(shù)稍高一點(diǎn)的那個條件。
對于標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)化，用HPLC的話只能用面積歸一化法了，我個人覺得用不同的條件出的峰肯定會略有差別的，我用兩個不同的條件分別來測定，這樣可以增大可靠性。這就有點(diǎn)像從中草藥中提取分離單體化合物一樣(不知道你在中草藥提取分離方面怎么樣?)，一般在分離中草藥中的單體化合物時，當(dāng)你懷疑用一個展開劑跑出來的點(diǎn)是個單體的話，一般你還需要換1-2種完全不同的展開劑進(jìn)行展開，或者要把硅膠換成聚酰胺或葡聚糖凝膠什么的。如果在變換了各種條件仍然是一個點(diǎn)，那基本就可以確定是個單體化合物了，然后再去打譜確定結(jié)構(gòu)。
對非水滴定法的說法比較贊成。首先要確定你的標(biāo)準(zhǔn)品的含量，至少應(yīng)該做正相，反相，DAD檢測。至于不同儀器，不同實驗室間的測試是另外一回事。 一般來講，用HPLC法來測定含量，是需要有對照品的，不管外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法都需要。而你做的是一類新藥，肯定沒有對照品。所以，我同意 cyl003135 的說法，需要有一個方法，作方法學(xué)研究。但肯定不能是HPLC法。可以用非水滴定法，用電位指示終點(diǎn)。作出滴定曲線。如果有合適的指示劑，可以比較一下，如果滴定終點(diǎn)電位與指示劑變色終點(diǎn)能夠統(tǒng)一，也可用指示劑指示終點(diǎn)。但仍要做線性、精密度、穩(wěn)定性、回收率等資料。必要時，需要作影響因素、加速、長期試驗考察對照品的穩(wěn)定性。
今天就我的這個問題去咨詢了我們省藥檢所化藥室的主任,她是這樣回答的：
1、要用兩個不同的方法來標(biāo)化。比如說我這個原料藥就可以采用非水滴定(容量分析法)和HPLC法(儀器分析法)。2、HPLC法必須采用兩個完全不同的條件來分別測定，用面積歸一化法來計算就可以了。
所謂不同的條件包括：
⑴完全不同的流動相(比如說我這個項目，目前我已經(jīng)摸索到了兩個不同的條件，雖然都是用的乙睛-水系統(tǒng)，但緩沖鹽和PH值分別都是不同的，所以就可以使用這兩個條件了。)
⑵不同品牌的色譜柱(就是換根柱子，至于國產(chǎn)還是進(jìn)口的倒是無所謂)
⑶不同品牌的HPLC色譜儀(如果條件實在不允許，在同一臺儀器上用不同的流動相和不同的色譜柱進(jìn)行測定也可以)
3、取三個方法含量的平均值就可以了。(我現(xiàn)在已經(jīng)用非水和一種HPLC條件測定過了，基本含量差距不大，如果差距很大，那就取含量低的那個方法的平均值)
4、HPLC法測定含量還是用UV檢測器為佳，不需要使用其他檢測器測定。
5、在藥品的研制過程中(包括新藥的臨床前申報)，作為研究單位，只要你用確實可靠的方法確定了你的標(biāo)準(zhǔn)品的含量就可以了。等到藥品被批準(zhǔn)上市的話，你提供標(biāo)準(zhǔn)品中檢所會測定含量的。最后的含量還是由中檢所確定的。基本上像上列方法測定標(biāo)準(zhǔn)品的含量是可以滿足申報新藥的要求的。
也許是我接觸的新藥研發(fā)比較少，完美的標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定在新藥研究中(比較嚴(yán)格的研究所我就不了解了)是很少那樣做的，基本就是像上面說的那個化藥室的主任所說的，大家一般都是只要你法定機(jī)構(gòu)說了這樣做可以那就決不愿意多做工作的，呵呵，反正我是這個樣子。最后法定標(biāo)準(zhǔn)品的含量是要由中檢所給出的，不是你申報單位說了算。我想您說的化藥一般絕不會用歸一化法來測含量可能意思是指的一般質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的含量測定，那是不能用歸一法。但標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)定和含量測定應(yīng)該是兩個不同的概念。我以前做植化分離得到的單體給純度時，也一般就是只用歸一法，只是用不同的色譜條件、不同色譜柱等。
化藥標(biāo)準(zhǔn)品的含量測定首選還是化學(xué)法，根據(jù)化藥本身的性質(zhì)選方法，是非水滴定、酸堿滴定、電位滴定還是其他。你雖然做的是一類藥，但基本的大類你自己應(yīng)該比較清楚的，參考同類產(chǎn)品的原料含量測定的方法進(jìn)行方法學(xué)的摸索，只要你化學(xué)物的性質(zhì)分析清楚了，應(yīng)該不是什么問題。
原料含量測定是化學(xué)法。現(xiàn)在大家儀器用慣了，總喜歡一開始就用HPLC法。其實大家看看新藥研究指南中的內(nèi)容，原料藥首選是化學(xué)法的。只有在化學(xué)法不能的情況下才用HPLC。要用HPLC就要用到標(biāo)準(zhǔn)品。你本來就是要做化藥標(biāo)準(zhǔn)品的含量測定，當(dāng)然是要用化學(xué)法。
藥檢所的答案也是很官方的。因為你也許也能通過。但是為什么不去自己找一個好的化學(xué)法去做含量測定的方法呢。制劑才首選液相方法。你可以用化學(xué)法測定自己提純好的原料藥做標(biāo)準(zhǔn)品。
標(biāo)化應(yīng)該不是測定含量的問題，測定含量的前提就是有對照品，沒有對照品的情況下如何保證測定的準(zhǔn)確性?如何進(jìn)行方法評價?
標(biāo)化的過程應(yīng)該是雜質(zhì)測定的過程，主要包括(1)HPLC色譜雜質(zhì)，(2)水分，(3)無機(jī)鹽，(4)殘留溶劑;除去所有雜質(zhì)的量即可得到對照品的純度。前面提到的方法在國內(nèi)盡管可用，但不能稱其為標(biāo)化。
一個新藥在制定標(biāo)準(zhǔn)品的時候，往往已經(jīng)有了該新藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案。那么，該標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)首先按照該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)做一下全面的質(zhì)量檢查(用到對照品的項目除外);如果該對照品的精制過程不同于藥物的精制工藝，則應(yīng)針對該精制過程做相應(yīng)的化學(xué)檢查。一般的化學(xué)雜質(zhì)應(yīng)很低。
使用HPLC做純度分析是必須的，如果不適用，則至少應(yīng)借助TLC分析其純度。均應(yīng)選取完全不同的流動相，證明其雜質(zhì)是被分開的。HPLC應(yīng)用二極管檢測器測定主峰的純度，若懷疑有UV不能檢測的雜質(zhì)，則應(yīng)再選用其他檢測器測試一下。
如果純度很高，則可以采用面積歸一化法定量。如果有較大雜質(zhì)，應(yīng)確定較大雜質(zhì)的性質(zhì)及相對響應(yīng)因子，也可以通過確定最大雜質(zhì)的量來確定主含量。測定的結(jié)果應(yīng)當(dāng)與另外一種方法如化學(xué)法比對，以驗證其正確性。
首先要明白什么叫標(biāo)化。利用基準(zhǔn)物質(zhì)(或用已知準(zhǔn)確濃度的溶液)來確定標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的操作過程，稱為“標(biāo)定”或稱“標(biāo)化”。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)化雖然沒有嚴(yán)格的定義，但其基本意義應(yīng)該是一致的，如果不知道一個已知含量如何確定未知含量。
使用UV檢測器可以看做是將分離開(是否真正分離開恐怕DAD的峰純度檢測也無法說明)的物質(zhì)使用分光光度法測定其吸收度，在沒有確定含量的基準(zhǔn)物時很難得知被標(biāo)定物的含量。至于歸一化法，如果不是使用通用型檢測器(蒸發(fā)光，MS)光靠一個UV(包括DAD)首先很難選定測定波長，如果人為因素參預(yù)其中，那就不是一個誤差可以形容的了;其次流動相的選擇，比如甲醇：水，和甲醇：水(緩沖鹽)，在這里加入緩沖鹽其造成流動相洗脫能力差異有多大，是否如 TLC 中使用三種不同極性的展開劑進(jìn)行實驗?zāi)敲从姓f服力。
選用三種方法測定后取其平均值，其統(tǒng)計學(xué)意義何在。三種方法的誤差來源不同，用三個方法分別測定6次，再取其平均值，是否還需要考察方法的耐用性，不同的人不同天里用不同的方法測定后進(jìn)行t檢驗，總之想起來頭都痛了。
個人認(rèn)為首先選取一種化學(xué)分析法測定其含量，再用HPLC偶聯(lián)通用型檢測器歸一化法測定，或者采用內(nèi)標(biāo)法測定含量(內(nèi)標(biāo)不好選，但也不是不能選)，對這幾組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，判定其是否有差異，也許是一個辦法。
根據(jù)本人經(jīng)驗，建議可以在工作的基礎(chǔ)上嘗試NMR定量法。最常用的HPLC法終歸只是面積歸一化，是相對含量，對于沒有紫外吸收的雜質(zhì)難以檢測。而 NMR可以做到絕對定量，有多少定量質(zhì)子信號就對應(yīng)相應(yīng)的純物質(zhì)量。我做過此方面的研究，比較可行，但需根據(jù)你化合物的結(jié)構(gòu)選擇合適的定量內(nèi)標(biāo)和溶劑、適宜的樣品濃度、適宜的一組或幾組定量質(zhì)子、多次采樣、多次積分、優(yōu)化馳豫時間等，只是需要做方法學(xué)的考察。
